Содержание доступно на ScienceDirect

Журнал исследования женьшеня

Домашняя страница журнала: http://www.ginsengres.org

J Ginseng Res 40 (2016) 68—75

Научная статья

Сравнительная характеристика фенольных соединений и антиоксидантная активность плодов, листьев и корней корейского женьшеня (Panax ginseng Meyer) в соответствии со сроками выращивания

Ил-Мин Чунг 1, Джу-Джин Лим 1, Мун-Сеоб Ан 2, Хает-Ним Чжон 2, Тэ-Джин Ан 3, Сон Хён Ким 1,*

1 Кафедра прикладной бионауки, Колледж естественных наук и наук об окружающей среде, Университет Конкук, Сеул, Республика Корея

2 Научно-исследовательский институт женьшеня и лекарственных растений, Канвондон, Чеурвон, Республика Корея

3 Отдел исследований травяных культур, NIHHS, RDA, Ымсон, Республика Корея

ИНФОРМАЦИЯ О СТАТЬЕ

История статьи:

Получена 14 октября 2014 г.

Получена в редакции от

29 апреля 2015 г.

Принята 13 мая 2015 г.

Доступна онлайн 22 мая 2015 г.

Ключевые слова:

антиоксидантная активность

годы выращивания

части женьшеня

Panax ginseng

фенольные профили

АННОТАЦИЯ

Справочная информация: Изучение профилей фенольных соединений и их антиоксидантной активности в плодах, листьях и корнях женьшеня с точки зрения срока выращивания, о которых до настоящего времени мало сообщалось. Следовательно, в этом исследовании изучались профили фенольных соединений и активность по захвату свободных радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) в плодах, листьях и корнях корейского женьшеня (Panax ginseng Meyer) в качестве функции года выращивания.

Методы: Профилирование 23 фенольных соединений в плодах, листьях и корнях женьшеня было исследовано с помощью жидкостной хроматографии сверхвысокой производительности с методом внешней калибровки. Антиоксидантную активность плодов, листьев и корней женьшеня оценивали с помощью метода активности захвата свободных радикалов DPPH.

Результаты: Общее содержание фенола в плодах и листьях женьшеня было выше, чем в корнях женьшеня (р <0,05), а содержание фенола в образцах женьшеня значительно коррелировало с активностью захвата свободных радикалов DPPH (r = 0,928****) , В частности, п-кумаровая кислота (r = 0,847****) и феруловая кислота (r = 0,742****) сильно повлияли на активность DPPH. Среди 23 изученных фенольных соединений фенольные кислоты были более распространены в плодах, листьях и корнях женьшеня, чем авоноиды и другие соединения (р <0,05). В частности, хлорогеновая кислота, гентизиновая кислота, п— и м-кумаровая кислоты и рутин были основными фенольными соединениями в 3-6-летних плодах, листьях и корнях женьшеня.

Заключение: Это исследование предоставляет основную информацию об антиоксидантной активности и профилях фенольных соединений в плодах, листьях и корнях корейского женьшеня с годами выращивания. Эта информация потенциально полезна для производителей женьшеня и отраслей, занимающихся производством высококачественных и питательных продуктов из женьшеня.

Авторское право © 2015, Корейское общество женьшеня, Опубликовано компанией Elsevier Ltd. Статья находится в открытом доступе согласно лицензии CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Введение

Женьшень (Panax ginseng Meyer) — это многолетнее растение, принадлежащее к семейству Аралиевые, которое используется в качестве лекарственного растения или в качестве натурального тоника во многих азиатских странах уже более 2000 лет [1]. Хотя женьшень в настоящее время распространяется в 35 странах, только четыре страны, Китай, Корея, Канада и США, ответственны за> 99% мирового производства женьшеня. Мировой рынок женьшеня оценивается в 2084 млн. долларов; в частности, корейский рынок оценивается в 1140 млн. долларов, что является крупнейшим рынком в мире [2]. Производство женьшеня в Корее в 2012 году оценивалось в 26 057 тонн, а свежий женьшень составлял 50% этого производства. Еще 44% произведенного женьшеня было использовано для производства красного женьшеня и обработанных продуктов, таких как пищевые добавки, лекарства, напитки, супы и желе [2,3].

* Автор представленного доклада для контакта. Кафедра прикладной бионауки, Колледж естественных наук и наук об окружающей среде, Университет Конкук, Сеул 143-701, Республика Корея.

Адрес эл. почты: kshkim@konkuk.ac.kr (С.-Х. Ким).

p1226-8453 e2093-4947/$ — см. вступительную часть © 2015, Корейское общество женьшеня, Опубликовано компанией Elsevier Ltd. Это статья с открытым доступом по лицензии CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

http://dx.doi.org/10.1016/j.jgr.2015.05.006

Известно, что женьшень обладает различными биологическими и фармакологическими свойствами, такими как иммуностимулирующие, противоопухолевые, противорвотные, антиоксидантные и антипролиферативные свойства, а также другие преимущества для здоровья [4—8]. Эти биологические и фармакологические свойства тесно связаны с фитохимическими веществами, присутствующими в женьшене, включая сапонины, алкалоиды, полиацетилены, полисахариды, свободные аминокислоты, полифенолы и летучие соединения, такие как лимонен [9—11]. В частности, известно, что корейский женьшень обладает лучшими биологическими и фармакологическими свойствами, чем другие виды женьшеня [12].

Недавние исследования показали биологическую и фармакологическую активность женьшеня, особенно корня женьшеня. Кроме того, также сообщалось об изменении химических составляющих (особенно гинзенозидов) корней женьшеня в зависимости от условий обработки, используемых при производстве женьшеня [13— 17]. Тем не менее, только в ограниченном количестве исследований сообщалось о химических составляющих или биологической активности цветов, плодов (ягод) и/или листьев женьшеня [18—21].

Фенольные соединения, присутствующие в женьшене, обладают различными биологическими свойствами, такими как антиоксидантные и противораковые свойства; однако эти соединения относительно менее известны потребителям по сравнению с гинзенозидами, которые в основном содержатся в корнях женьшеня. Ранее сообщалось о наличии более 10 фенольных соединений, включая кофейную кислоту, феруловую кислоту, ваниловую кислоту, п-гидроксибензойную кислоту, гентизиновую кислоту и сириновую кислоту, в свежем и/или обработанном женьшене [10,13,22]. Насколько нам известно, недостаточно информации о том, как состав и содержание фенольных соединений, содержащихся в плодах, листьях и корнях женьшеня, зависят от срока выращивания. Следовательно, в этом исследовании сообщается об общем содержании фенола и профиле 23 фенольных соединений, присутствующих в плодах, листьях и корнях корейского женьшеня возрастом 3-6 лет. Кроме того, мы определили активность по очистке свободных радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) плодов, листьев и корней 3-6-летнего корейского женьшеня и провели корреляционный анализ между фенольным профилем и антиоксидантной активностью DPPH, наблюдаемой в плодах, листьях и корнях женьшеня. Это исследование расширяет современные знания о профиле фенольных соединений в плодах, листьях и корнях женьшеня в зависимости от времени выращивания и предоставляет полезную информацию для отраслей, заинтересованных в производстве продуктов из женьшеня.

Материалы и методы

Материалы женьшеня

Плоды, листья и корни женьшеня в возрасте от трех до шести лет были получены на Экспериментальной станции «Женьшень и лекарственные растения» (N38 ○ 15013300 / E127 ○ 23037500), Службы исследований и распространения сельскохозяйственных культур в Канвондо в Корее. Плоды и листья были случайным образом собраны в августе 2012 года, а корни были случайным образом собраны в период с августа 2012 года по октябрь 2012 года. Образцы женьшеня (плоды, листья и корни) были собраны и хранились при -70°С до тех пор, пока они не потребуются для анализа. Все землеустройство, включая химическую обработку пестицидами и гербицидами, проводилось с использованием местных рекомендаций в период выращивания женьшеня [13].

Химические вещества

23 фенольных стандарта, использованных в этом исследовании (галловая кислота, протокатеховая кислота, п-гидроксибензойная кислота, гентизиновая кислота, хлорогеновая кислота, катехин, сиринговая кислота, ванилин, феруловая кислота, о-кумаровая кислота, м-кумаровая кислота, п -кумарная кислота, рутин, нарингин, мирицетин, резвератрол, транс-коричная кислота, кверцетин, нарингенин,

кемпферол, гесперетин, формононетин и биоханин А), были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури, США). Радикал DPPH, реагент Фолина-Чокальтеу и карбонат натрия (Na₂CO₃) также были приобретены у Sigma-Aldrich. Соляная кислота (HCl, 0,1 N) была приобретена у компании Daejung Chemical & Materials Co. Ltd. (Кёнгидо, Корея). Вода и метанол (MeOH) были получены от компании Fisher Scientific Korea Ltd. (Сеул, Корея). Ацетонитрил (ACN) был приобретен у компании Merck (Дармштадт, Германия). Ледяная уксусная кислота была получена от компании J. T. Baker (Филипсбург, Нью-Джерси, США). Все растворители, использованные для экстракции образцов и инструментального анализа, имели аналитическую чистоту высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Извлечение образца

Анализ фенольных соединений в образцах женьшеня проводился с использованием модификации предыдущего метода [23]. Вкратце, каждый образец женьшеня лиофилизировали при температуре ниже —40°С (Freexeone 4.5, Labconco, Канзас-Сити, Миссури, США) и затем измельчали перед экстракцией образца. Образец измельченного женьшеня (1 г) добавляли к 10 мл ACN и 2 мл 0,1 N HCl и полученную смесь экстрагировали с помощью шейкера (Green-Seriker, Vision Scientific Co. Ltd., Кёнгидо, Корея) при 200 об/мин в течение 2 ч при комнатной температуре. Неочищенный экстракт женьшеня фильтровали через фильтровальную бумагу № 42 Whatman (Мейдстон, Великобритания); фильтрат концентрировали в вакууме при <35°С с использованием вакуумного испарителя (SB-1200, EYELA, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Япония). Остаток ресуспендировали 80% водным МеОН (5 мл) и затем фильтровали через 0,2 мм шприцевой фильтр (17 мм, TITAN, Роквуд, Теннесси, США). Этот фильтрат использовали для анализа фенольных соединений, присутствующих в образце женьшеня, и измерения активности захвата свободных радикалов DPPH.

Определение общего содержания фенола с использованием метода Фолина-Чокальтеу

Общее содержание фенола в образцах женьшеня измерялось методом Фолина-Чокальтеу [24]. Вкратце, аликвоту (20 мл) образца женьшеня или фенольного стандарта (т.е. галловой кислоты) смешивали с водой (1,58 мл) и реагентом Фолина-Чокальтеу (100 мл). Через 8,5 мин к смеси образцов добавляли насыщенный раствор карбоната натрия (300 мл), который затем перемешивали и хранили при комнатной температуре в течение 2 часов. Общее содержание фенола в образцах женьшеня измеряли с использованием УФ-спектрофотометра OPTIZEN POP (Mecasys Co., Тэджон, Корея) при 765 нм. В этом исследовании общее содержание фенола в образцах женьшеня выражали в эквиваленте галловой кислоты (GAE, мкг/г, в пересчете на сухую массу). Внешнюю калибровочную кривую получали с использованием 10-1000 мг/мл галловой кислоты, и в этом диапазоне наблюдалась хорошая линейность (r² = 0,9954).

Профиль 23 фенольных соединений в женьшене с использованием ультра-ВЭЖХ

Присутствие 23 фенольных соединений в образцах женьшеня измеряли с использованием ультра-ВЭЖХ (UHPLC, система ACCELA UHPLC, Thermo Fisher Scientific Inc., США) с колонкой с обращенной фазой (Thermo, C₁₈, 2,1 × 100 мм, 2,6 мм). Ранее сообщенные аналитические условия [13] были немного изменены для нашего UHPLC анализа. Используемая подвижная фаза состояла из 0,1% ледяной уксусной кислоты в дистиллированной воде (растворитель A) и 0,1% ледяной уксусной кислоты в ACN (растворитель B). Линейный градиент подвижной фазы состоял из: 0 мин: 98% (A) -2% (B); 0,50 мин: 95% (A) -5% (B); 2,20 мин: 90% (A) -10% (B); 5,00 мин: 85% (A) -15% (B); 7,50 мин: 84,3% (A) -15,7% (B); 8,00 мин: 83,4% (A) -16,6% (B); 9,00 мин: 82,2% (A) -17,8% (B); 9,50 мин: 76,1% (A) -23,9% (B); 14,00 мин: 55,0% (A) -45,0% (B); 15,00 мин: 0% (A) -100% (B); 15,50 мин: 0% (A) -100% (B); 16,00 мин: 98% (A) -2% (B); 25,00 мин: 98% (A) -2% (B). Скорость потока подвижной фазы составляла 0,5 мл/мин, а объем впрыска составлял 4 мкл. Абсорбцию фенольных соединений образцов женьшеня измеряли при 280 нм.

Количественная оценка фенольных соединений

Метод внешней калибровочной кривой использовался для количественного определения 23 фенольных соединений, присутствующих в плодах, листьях и корнях женьшеня. 23 фенольных стандарта были приготовлены либо в MeOH, либо в диметилсульфоксиде (ДМСО) в виде исходного раствора с концентрацией 100 ч/млн. Калибровочные кривые (3-7 баллов) с соответствующими разведениями каждого стандартного исходного раствора были использованы для количественной оценки, а диапазоны концентраций, использованных для 23 фенольных стандартов, приведены в Талице 1. Фенольные соединения были определены путем сравнения времени выдержки оригинальных фенольных стандартов и пиков, наблюдаемых в аликвоте образца (Рис. 1). Кроме того, каждый фенольный стандарт был также добавлен (усилен) к аликвоте образца (аликвота образца + фенольный стандарт обозначена красной сплошной линией на Рис. 1B-D) для подтверждения правильного назначения пиков в образцах женьшеня. Все калибровочные кривые показали хорошую линейность (r²> 0,99) в диапазонах концентраций, исследованных в этом исследовании. Предел обнаружения (LOD) и предел количественной оценки (LOQ) для 23 фенольных соединений определяли с использованием каждой калибровочной кривой следующим образом: LOD = 3 × SD/S и LOQ = 10 × SD/S, где SD — стандартное отклонение отклика, а S — наклон калибровочной кривой [25]. В этом исследовании LOD варьировался от 0,003 ч/млн до 0,396 ч/млн (мг/мл), а LOQ варьировался от 0,011 ч/млн до 1,332 ч/млн (Таблица 1).

Измерение активности захвата свободных радикалов DPPH

Активность захвата свободных радикалов DPPH измеряли по известной методике [26] с некоторыми модификациями. 0,4 мМ раствора DPPH подготавливали в МеОН, и 2,8 мл этого раствора смешивали с аликвотой по 0,2 мл каждого образца женьшеня (см. Экстракция образца). Смесь помещали в темную комнату на 10 минут и затем измеряли поглощение с использованием УФ-спектрофотометра OPTIZEN POP при 517 нм. Активность захвата свободных радикалов DPPH рассчитывали как процент ингибирования на основе следующего уравнения: Ингибирование (%) = [(A₀-A₁)/A₀] × 100, где A₀ — абсорбция

контроля, а A₁ — абсорбция аликвоты образца женьшеня.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием общей процедуры линейной модели и корреляционного анализа программы статистического анализа (SAS, Версия 9.3, SAS Institute Inc. Кэри, Северная Каролина, США). План исследования, включая отбор образцов и все инструментальные измерения, были полностью рандомизированными в трех экземплярах. Наименее значимое другое испытание было основано на уровне вероятности 0,05.

Результаты

В Таблице 2 показано общее содержание фенола в плодах, листьях и корнях женьшеня в зависимости от срока выращивания. Общее содержание фенола в плодах, листьях и корнях женьшеня зависело от срока выращивания (р <0,05). Общее содержание фенола в 3-6-летних плодах и листьях женьшеня было в 4-9 раз выше, чем в 3-6-летних корнях женьшеня (р <0,05). Кроме того, общее содержание фенола в плодах, листьях и корнях женьшеня в возрасте 3-6 лет составляло приблизительно 0,03–0,3% от каждого образца женьшеня (в пересчете на сухую массу). Более молодые листья женьшеня (3 года и 4 года) имели более высокое общее содержание фенола, чем более старые листья женьшеня (5 и 6 лет). Содержание общего фенола значительно уменьшилось в 6-летних листьях женьшеня. Напротив, у более старых плодов женьшеня общее содержание фенола было выше, чем у более молодых плодов женьшеня (р <0,05).

В Таблице 3 показано содержание и состав 23 фенольных соединений, обнаруженных в плодах, листьях и корнях женьшеня по срокам выращивания. Общее количество 23 фенольных соединений было значительно выше в 3-6-летних плодах женьшеня, чем в 3-6-летних корнях и листьях женьшеня (р <0,05). В целом, общее количество 23 фенольных соединений в корнях и плодах женьшеня увеличилось на 20-48% с увеличением срока выращивания. Напротив, общее количество 23 фенольных соединений уменьшилось на 40-50% в 6-летних листьях женьшеня по сравнению с количеством, обнаруженным в 3-летних листьях женьшеня (р <0,05). Эти 23 фенольных соединения составляли 30-50% (корни женьшеня), 80-90% (плоды женьшеня) и ~20% (листья женьшеня) от общего содержания фенола, измеренного в этом т

Таблица 1

Диапазон концентраций, линейность, предел обнаружения и предел количественного анализа 23 фенольных стандартов, исследованных в этом исследовании

Группы	Химические вещества	Аббревиатура	Концентрация1) мкг/мл	Линейность (r2)	Наклон (S)	SD отклика	LOD2) мкг/мл	LOQ2) мкг/мл
Фенольная кислота	Галловая кислота	GA	0.01-1	1	9 745,7	27,7	0,008	0,028
Фенольная кислота	Протокатеховая кислота	PA	0.01-10	1	11 112	102,7	0,027	0,092
	Гентизиновая кислота	GT	0.01-50	0,9986	3 837,9	58,9	0,056	0,185
	п-гидроксибензойная кислота	pH	0.01-10	0,9995	15 681	2 074,9	0,396	1,323
	Сириновая кислота	SA	0.01-25	0,9949	27 748	2 371,1	0,299	0,999
	Хлорогеновая кислота	CA	0.01-50	0,9901	5 469,2	278,2	0,078	0,260
	п-кумаровая кислота	pC	0.01-25	0,9852	7 268,2	27,5	0,008	0,026
	Феруловая кислота	FA	0.01-5	0,9994	11 944	876,5	0,22	0,733
	м-кумаровая кислота	mC	0.01-100	0,9966	48 157	226,7	0,013	0,044
	о-кумаровая кислота	oC	0.01-1	1	30 379	143,9	0,014	0,047
	т-коричная кислота	tC	0.01-1	1	79 059	130,4	0,004	0,016
Флавоноид	Нарингин	NA	0.01-1	1	12 082	22,9	0,005	0,019
	Катехин	CN	0.01-1	1	2 335,2	2,7	0,003	0,011
	Нарингенин	NG	0.01-10	0,9999	23 238	1 321,1	0,170	0,568
	Гесперетин	HN	0.01-1	1	27 844	146,1	0,015	0,052
	Рутин	RN	0.01-25	0,9999	4 857,6	461,7	0,285	0,950
	Мирицетин	MY	0.01-1	0,9962	117,79	5,6	0,142	0,475
	Кверцетин	QN	0.01-1	0,9992	5 995,9	128,1	0,064	0,213
	Формононетин	FN	0.01-1	1	25 179	108,4	0,012	0,043
	Кемпферол	KA	0.01-5	0,9986	10 117	1 094,9	0,324	1,082
	Биочанин A	BA	0.01-1	0,9999	15 953	116,5	0,021	0,073
Прочее	Ресвератрол	RE	0.01-1	0,9999	31 260	54,2	0,005	0,017
	Ванилин	VN	0.01-1	0,997	39 731	5 077,3	0,383	1,277

1) Калибровочную кривую получали с использованием 3-7 различных концентраций каждого раствора фенольного стандарта

2) Предел обнаружения (LOD) и предел количественного анализа (LOQ) определяли с использованием каждой калибровочной кривой следующим образом: LOD = 3 × SD/S и LOQ = 10 × SD/S, где SD — стандартное отклонение отклика, S — наклон каждой калибровочной кривой

смесь 23 фенольных стандарта

Время выдерживания, мин

м-кумаровая кислота

Сириновая кислота

Ресвератрол

Феруловая кислота

о-кумаровая кислота

Биоханин А

Формононетин

т-коричная кислота

Хлорогеновая кислота

лист 3-летнего женьшеня в сравн. с листом 3-летнего женьшеня, усиленным четырьмя стандартами

плод 3-летнего женьшеня в сравн. с плодом 3-летнего женьшеня, усиленным четырьмя стандартами

корень 3-летнего женьшеня в сравн. с корнем 3-летнего женьшеня, усиленным четырьмя стандартами

Рис. 1. Типичные хроматограммы ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии (UHPLC) смеси 23 образцов фенольного стандарта (A) и образцов женьшеня (B-D; черная сплошная линия обозначает образец женьшеня, а красная сплошная линия обозначает тот же образец женьшеня, обогащенный некоторыми фенольными стандартами). (A) 1. галловая кислота, 2. протокатеховая кислота, 3. гентизиновая кислота, 4. п-гидроксибензойная кислота, 5. хлорогеновая кислота, 6. катехин, 7. сириновая кислота, 8. ванилиновая кислота, 9. п-кумаровая кислота, 10. феруловая кислота, 11. м-кумаровая кислота, 12. рутин, 13. о-кумаровая кислота, 14. нарингин, 15. мирицетин, 16. ресвератрол, 17. транс-коричная кислота, 18. кверцетин, 19. нарингенин 20. кемпферол, 21. гесперетин, 22. формононетин и 23. биоханин А; (B) четыре фенольных стандарта (хлорогеновая кислота, транс-коричная кислота, формононетин и биоханин А) были добавлены в образец 3-летнего корня женьшеня; (C) четыре фенольных стандарта (хлорогеновая кислота, феруловая кислота, о-кумаровая кислота и ресвератрол) были добавлены в образец 3-летних плодов женьшеня; (D) три фенольных стандарта (хлорогеновая кислота, сириньяновая кислота и м-кумаровая кислота) были добавлены в образец 3-летних листьев женьшеня.

Таблица 3

Получение 23 фенольных соединений в корне, плодах и листьях женьшеня по времени выращивания¹⁾

Сумма

мг/г, сухая масса

83.54^a

92.90^b

100.85^b

173.72^a

1,974.31^b

1,899.55^c

2,518.13^a

2,446.35^a

517.58^b

596.96^a

577.91^a

296.20^c

н/о = не обнаружено

¹⁾Результаты выражены в виде среднего значения ± SD (n = 3). Значения, выделенные разными буквами, статистически различались в зависимости от года выращивания^а-d (р <0,05)

Прочее

0.58^a

0.30^bc

0.24^c

0.47^ab

н/о

0.22^c

0.79^b

1.60^a

0.21^c

1.06^a

1.08^a

0.87^c

0.96^b

15.97^d

29.42^a

23.88^c

27.20^b

3.29^a

3.21^ab

2.78^bc

2.65^c

Флавоноид

н/о

0.25^a

0.12^b

0.14^b

0.13^b

0.46^a

0.25^b

0.50^a

0.48^a

0.34^a

0.14^b

0.05^c

0.07^c

0.96^a

0.80^ab

0.60^b

0.87^a

0.46^c

1.67^b

2.26^a

2.37^a

0.14^c

0.28^ab

0.34^a

0.23^b

н/о

0.67^a

0.50^b

30.48^b

29.46^b

20.95^c

34.97^a

1.87^d

3.13^c

3.43^b

3.85^a

н/о

0.91^a

1.12^a

1.60^a

1.47^a

н/о

2.54^b

2.73^b

3.03^a

8.29^b

10.37^a

5.15^d

6.31^c

1.30^ab

1.79^a

1.02^b

1.13^b

8.28^a

6.74^ab

2.77^c

4.76^bc

126.74^d

170.70^a

137.20^c

156.93^b

38.60^a

24.39^b

21.73^b

19.77^b

2.82^c

1.73^c

23.16^b

33.00^a

н/о

4.96^a

5.28^a

5.69^a

2.97^b

Фенольная кислота

1.09^b

1.24^a

1.12^ab

1.17^ab

0.22^c

0.64^a

0.25^c

0.30^b

0.93^a

0.98^a

0.97^a

0.56^b

0.38^c

0.60^b

0.46^c

0.70^a

0.19^c

0.57^a

0.38^b

0.43^b

0.57^a

0.37^b

0.60^a

0.28^b

5.04^b

5.07^b

5.05^b

5.17^a

20.35^c

28.64^a

23.89^b

19.98^c

155.24^b

261.13^a

156.88^b

62.05^c

2.87^a

1.71^b

1.16^c

1.33^c

12.74^b

11.87

16.49^a

15.05^a

3.37^c

3.95^c

11.24^a

6.53^b

3.18^a

2.25^b

2.08^b

2.10^b

53.76^c

59.29^b

74.34^a

59.49^b

121.88^a

90.75^c

109.13^b

63.68^d

н/о

34.30^d

56.58^b

53.54^c

65.65^a

9.82^a

н/о

7.42^c

10.79^b

11.55^b

13.61^a

1,075.54^c

929.51^d

1,377.28^a

1,323.59^a

126.21^a

69.52^b

125.41^a

61.93^b

1.99^c

3.66^a

2.26^c

3.09^b

3.55^d

11.88^a

5.68^c

8.38^b

1.37^c

13.66^a

11.38^a

5.72^b

7.65^c

17.07^b

19.76^b

61.72^a

614.38^c

580.11^d

787.95^a

749.00^b

17.97^c

91.95^a

108.54^a

54.31^b

6.93^ab

7.53^a

5.93^c

6.61^bc

5.46^b

4.90^c

5.89^b

7.32^a

30.41^a

28.84^a

19.61^b

12.13^c

н/о

Срок выращивания

Корень

Плод

Лист

Таблица 2

Общее содержание фенолов в корне, плодах и листьях женьшеня

по сроку выращивания1)

Срок выращивания	Корень	Плод	Лист
Срок выращивания		мкг/г, сухая масса
3 года	260.97 ± 27.62b,z	2,274.17 ± 459.34b,y	2,476.25 ± 421.55ab,x
4 года	301.94 ± 27.85a,z	2,286.67 ± 185.50b,y	2,640.83 ± 289.62a,x
5 лет	248.47 ± 50.30b,z	2,820.69 ± 396.10a,x	2,215.14 ± 238.19b,y
6 лет	334.58 ± 50.19a,z	2,676.94 ± 122.73a,x	1,270.00 ± 305.56c,y

1) Результаты выражены в виде среднего значения ± SD (n = 3). Значения, выделенные разными буквами, статистически различались по сроку выращивания^а-с или частей женьшеня^x-z (p < 0,05)

исследовании с использованием метода Фолина-Чокальтеу (Таблица 2). Этот результат указывает на то, что другие фенольные соединения, вероятно, присутствуют в листьях и корнях женьшеня, тогда как общее содержание фенола в плодах женьшеня в основном состоит из 23 фенольных соединений, измеренных в этом исследовании (Таблицы 2 и 3).

23 фенольных соединения, использованных в этом исследовании, можно классифицировать как 11 фенольных кислот, 10 флавоноидов и два других типа фенольных соединений. Таким образом, фенольные кислоты были более распространены, чем флавоноиды и другие соединения. Более того, плоды женьшеня содержали больше фенольных соединений, чем корни и листья женьшеня по всем срокам выращивания (Рис. 2). Было также обнаружено, что листья женьшеня содержат больше фенольных кислот, чем корни женьшеня, в то время как корни женьшеня содержат больше флавоноидов, чем листья женьшеня, за все сроки выращивания (p < 0.05).

Среди 23 фенольных соединений галловая кислота, мирицетин и биоханин А не были обнаружены в плоде, листьях и корнях 3-6-летнего женьшеня. Кроме того, в одной из 3-летних образцов женьшеня не было обнаружено сириновой кислоты, катехина, кверцетина, кемпферола и резвератрола. В корнях женьшеня нарингенин являлся основным фенольным соединением, и на его долю приходилось около 20–35% от общего количества 23 фенольных соединений за все годы культивирования. Гентизиновая кислота, хлорогеновая кислота и катехин в корнях женьшеня значительно увеличивались с увеличением срока выращивания (r ≥ 0,874****). Напротив, феруловая кислота (r = -0,780****), п-кумаровая кислота (r = -0,698****) и формононетин (r = -0,645****) снижались с увеличением срока выращивания, хотя их содержание в корнях женьшеня составляло небольшую часть (≤ 3,5%) от общего количества 23 фенольных соединений. Однако содержание других фенольных соединений не коррелировало или очень слабо коррелировало со сроком выращивания в этом исследовании (Таблица 3). Кроме того, хлорогеновая кислота была преобладающим фенольным соединением в плодах женьшеня и составляла 50% от общего количества 23 фенольных соединений. Гентизиновая кислота и рутин были следующими наиболее преобладающими фенольными соединениями, найденными в плодах женьшеня. Хлорогеновая кислота и м— и п-кумаровые кислоты (10-40%) были преобладающими фенольными соединениями, обнаруженными в листьях женьшеня. Количество 23 фенольных соединений в листьях женьшеня, как правило, уменьшалось с увеличением срока выращивания, тогда как количество 23 фенольных соединений, обнаруженных в более старых корнях и плодах женьшеня, было выше, чем в более молодых корнях и плодах женьшеня (Таблица 3).

В Таблице 4 показана активность захвата свободных радикалов DPPH (активность DPPH) плодов, листьев и корней 3-6-летнего женьшеня. В целом активность DPPH во все сроки выращивания ранжировалась следующим образом: плоды> листья> корни. Активность DPPH была в 3-5 раз выше у плодов женьшеня, чем у корней женьшеня; активность DPPH была также немного выше (5-14%) в плодах женьшеня, чем в листьях женьшеня (р <0,05). Активность DPPH корней женьшеня увеличивалась с увеличением срока выращивания, тогда как активность листьев женьшеня снижалась с увеличением срока выращивания (p <0,05). Эти результаты согласуются с теми, о которых сообщалось в предыдущем исследовании, которое показало, что активность DPPH была выше у плодов и листьев женьшеня, чем у корней женьшеня [27].

3-х летний

4-х летний

5-х летний

6-х летний

5-х летний

3-х летний

4-х летний

6-х летний

5-х летний

4-х летний

3-х летний

Лист

Плод

Корень

Рис. 2. Содержание трех типов фенольных соединений в плодах, листьях и корнях женьшеня по сроку выращивания. Результаты выражены как среднее значение ± SD (n = 3). Значения, выделенные разными буквами, статистически различаются в зависимости от частей женьшеня (р <0,05).

Обсуждение

Женьшень использовался в качестве популярного лекарственного растения или продукта питания в течение более 2000 лет из-за его различных преимуществ для здоровья. Женьшень в основном используется в качестве 4-летнего корня. Из-за особенностей роста женьшеня его выращивание требует специфического климата и специфических условий почвы [28]. Женьшень состоит из 60% углеводов, 8-15% сырого белка, 1-3% липидов, 4-6% золы, 3-7% неочищенного сапонина и других химических веществ, включая фенольные и летучие соединения [29].

В целом, гинзенозиды известны как основные фитохимические вещества женьшеня. Интерес к фенольным соединениям женьшеня в последнее время возрос из-за их различных биологических и фармакологических свойств, таких как антиоксидантные, противораковые и отбеливающие свойства, или из-за их способности снижать артериальную гипертензию [30,31]. Ранее сообщалось о более чем 10 фенольных соединениях в свежем и/или обработанном женьшене: салициловая кислота, ваниловая кислота, аскорбиновая кислота, п-кумаровая кислота, феруловая кислота, кофейная

Таблица 4

Активность захвата свободных радикалов 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) корня, плодов и листьев женьшеня по срокам выращивания1)

Срок выращивания

Корень

Плод

Лист

% ингибирования

3 года

4 года

6 лет

18,08 ± 0,972c,z

19,26 ± 1,14bc,z

20,01 ± 2,48b,z

25,61 ± 1,34a,z

89,64 ± 0,64c,x

92,42 ± 0,33a,x

88,28 ± 0,52d,x

91,05 ± 1,79b,x

85,17 ± 0,95a,y

83,52 ± 1,73ab,y

84,37 ± 3,10a,y

79,43 ± 8,03b,y

лет

Результаты выражены в виде среднего значения ±

SD (n = 3). Значения, выделенные разными буквами, статистически различались по срокам выращивания^а-c или частям женьшеня^x-z(p <0,05)

кислота, гентизиновая кислота, п-гидроксибензойная кислота, мальтол, коричная кислота, протокатеховая кислота, шприцевая кислота и кверцетин [22]. Среди этих фенольных соединений феруловая кислота считается фенольным соединением с противораковыми свойствами. Мальтол, который содержится в обработанном женьшене, проявляет сильную активность захвата против активных форм кислорода [32,33]. Корейский женьшень обычно содержит больше фенольных соединений, чем китайский женьшень; следовательно, корейский женьшень имеет больше пользы для здоровья, чем другие виды женьшеня [34].

В настоящем исследовании максимальное значение общего содержания фенола в корнях 3–6-летнего женьшеня составляло ~0,03% (в пересчете на сухую массу) с гентизиновой кислотой и нарингенином в качестве основных фенольных соединений. Согласно предыдущим исследованиям, общее содержание фенола составляло 0,42% (в пересчете на сухую массу) в корнях 5-летнего женьшеня и в основном состояло из этерифицированных и нерастворимых фенольных форм, а не свободных фенольных форм. Ваниловая кислота, феруловая кислота и гентизиновая кислота были наиболее распространенными фенольными кислотами в свободной, этерифицированной и нерастворимой фенольных формах соответственно [35]. Салициловая кислота, ваниловая кислота и п-кумаровая кислота были основными фенольными соединениями в свежих корнях женьшеня, несмотря на различные сорта женьшеня [36]. Кроме того, при использовании препаративной TLC было обнаружено, что полифенольное соединение (MW 578) встречается исключительно в свежем корейском женьшене; это соединение не было найдено в американском женьшене [37]. Различия в составе и содержании фенольных соединений между этим исследованием и предыдущими исследованиями, вероятно, возникли из-за использования различных методов экстракции, сортов женьшеня и других факторов (то есть условий выращивания, включая почву и климат).

В общем, плоды и листья женьшеня менее привлекательны для потребителей по сравнению с корнями женьшеня; фактически плоды и листья обычно выбрасывают [28]. Поэтому информация о фенольных соединениях, присутствующих в плодах или листьях женьшеня, на сегодняшний день очень ограничена. Традиционно листья женьшеня использовались как форма чая. Кроме того, листья женьшеня, выращенного гидропонным методом, недавно использовались в качестве салата [28]. Кроме того, сообщалось, что ягоды американского женьшеня подавляют рост колоректального рака как in vitro, так и in vivo [38].

Сообщалось, что листья выращиваемого в почве женьшеня содержат больше коричной кислоты, чем п-кумаровой кислоты [39]. В противоположность этому, листья женьшеня, выращенного гидропонным методом, содержат большее количество п-кумаровой кислоты. Кроме того, количество коричной кислоты было выше только в плодах женьшеня, выращенного гидропонным методом. Кроме того, мальтол не был обнаружен ни в плодах женьшеня, ни в листьях [28]. В частности, п-кумаровая кислота известна как эффективный антиоксидант, который отвечает за активность захвата радикалов ABTS (2, 2’-азино-бис (3-этилбензотиазолин) -6-сульфоновой кислоты). Различное количество этого соединения в разных частях женьшеня можно использовать для объяснения более высокой ABTS-активности листьев по сравнению с плодами и корнями женьшеня, выращенного гидропонным методом [28,40].

В нашем исследовании общее содержание фенола составляло 0,22-0,28% в плодах женьшеня и 0,13-0,26% в листьях женьшеня. Хлорогеновая кислота и гентизиновая кислота были наиболее распространенными фенольными соединениями в плодах женьшеня, за которыми следовали рутин, п-кумаровая кислота и салициловая кислота. Кроме того, хлорогеновая кислота и м— и п-кумаровые кислоты также были основными фенольными соединениями в листьях женьшеня. Фенольные составы и содержание, определенные в этом исследовании, немного отличались от ранее сообщенных [28,39]. На фенольные профили плодов и листьев женьшеня влияли несколько факторов, таких как сорт женьшеня, условия культивирования, метод экстракции и/или период сбора урожая. В частности, период сбора плодов и листьев женьшеня имел решающее значение для состава и содержания фенольных соединений, потому что различные метаболиты (включая фенольные соединения, описанные в этом исследовании) были в значительной степени затронуты стадиями роста и развития женьшеня. В настоящем исследовании плоды и листья женьшеня собирали в течение ограниченного периода (август 2012 года для плодов и

листьев женьшеня; август – октябрь 2012 года для корней женьшеня) с множественными повторениями, чтобы минимизировать любые изменения в фенольных соединениях, обнаруженных в плодах и листьях женьшеня. Эта методология может быть одной из критических причин, по которым профили фенольных соединений в этом исследовании отличаются от ранее сообщенных.

Корреляционный анализ показал, что общее содержание фенола увеличилось в корнях женьшеня (r = 0,365*) и плодах (r = 0,501**) и уменьшилось в листьях женьшеня (r = -0,740****) с увеличением срока выращивания. Кроме того, общее количество 23 фенольных соединений увеличилось в корнях женьшеня (r = 0,847****) и плодах (r = 0,801****) и уменьшилось в листьях женьшеня (r = -0,581***) со сроком выращивания. Также было обнаружено, что активность DPPH возрастала в корнях женьшеня (r = 0,799****) и снижалась в листьях женьшеня (r = -0,389*) с увеличением срока выращивания. Активность DPPH плодов женьшеня статистически не коррелировала со сроками выращивания.

Кроме того, фенольные кислоты, но не флавоноиды, существенно влияли на общее количество 23 фенольных соединений (r = 0,999 ***) и общее содержание фенола (r = 0,734 ***) в образцах женьшеня; Этот результат показывает, что фенольные кислоты являются преобладающим типом фенольного соединения в плодах, листьях и корнях женьшеня. Кроме того, количество фенольных кислот в образцах женьшеня также возрастало с увеличением количества флавоноидов (r = 0,888 ***) и других соединений (r = 0,939 ***). В частности, положительно коррелировали хлорогеновая кислота (r = 0,639 ****), п-кумаровая кислота (r = 0,831 ****) и феруловая кислота (r = 0,699 ****) и нарингенин (r = — 0,857 ****) отрицательно коррелировали с общим содержанием фенола в женьшене. Этот результат означает, что общее содержание фенола увеличивается с увеличением содержания хлорогеновой кислоты, п-кумаровой кислоты и феруловой кислоты в женьшене, а также с уменьшением количества нарингенина в женьшене. Кроме того, содержание изомеров кумаровой кислоты (о-, м— и п-) в женьшене статистически не коррелировало с типом изомера (р> 0,637).

Активность DPPH сильно коррелировала с общим содержанием фенола в плодах, листьях и корнях женьшеня (r = 0,928****); активность DPPH также значительно коррелировала с общим содержанием фенольных кислот (r = 0,707***). В частности, содержание фенольных кислот, таких как п-кумаровая кислота (r = 0,847****), феруловая кислота (r = 0,742****) и хлорогеновая кислота (r = 0,612****), значительно повлияло на активность DPPH. Однако содержание катехина (r = 0,770****) или нарингенина (r = 0,939****) в женьшене отрицательно коррелировало с активностью DPPH.

В заключение, в настоящем исследовании сообщается о профиле фенольных соединений и антиоксидантной активности плодов, листьев и корней корейского женьшеня по отношению к сроку выращивания. Общее содержание фенола в плодах, листьях и корнях 3–6-летнего женьшеня составляло 0,03 ± 0,3% (в пересчете на сухую массу) в каждом образце женьшеня, и было обнаружено, что содержание фенола в плодах и листьях женьшеня обычно выше, чем в корнях женьшеня (р <0,05). Общее содержание фенола в корнях женьшеня (r = 0,365*) и плодах (r = 0,501**) увеличивалось с увеличением срока выращивания, тогда как содержание в листьях женьшеня (r = — 0,740****) уменьшалось. Среди 23 изученных фенольных соединений фенольные кислоты были более распространены в плодах, листьях и корнях женьшеня, чем флавоноиды и другие соединения (р <0,05). Это исследование показало, что хлорогеновая кислота, гентизиновая кислота, п— и м-кумаровая кислоты и рутин были основными фенольными соединениями в 3-6-летнем плоде, листьях и корнях женьшеня. Напротив, галловая кислота, мирицетин и биоханин А не были обнаружены в 3-6-летнем плоде, листьях и корнях женьшеня. Кроме того, активность DPPH значительно коррелировала с общим содержанием фенола в образцах женьшеня (r = 0,928****). В частности, п-кумаровая кислота (r = 0,847****) и феруловая кислота (r = 0,742****) сильно повлияли на активность DPPH. Это исследование предоставляет основную информацию о составе и содержании фенольных соединений в плодах, листьях и корнях женьшеня в зависимости от срока выращивания. Эта

информация потенциально полезна для производителей женьшеня и отраслей, занимающихся производством высококачественных и питательных продуктов из женьшеня.

Конфликт интересов

У авторов нет конфликта интересов.

Подтверждения

Эта работа была выполнена при поддержке Совместной исследовательской программы развития сельскохозяйственной науки и техники (PJ008567052015), Управление по развитию сельскохозяйственных районов, Республика Корея. Это исследование было поддержано программой Ku Brain Pool 2015 года. Авторы благодарят рецензентов за глубокие и полезные комментарии.

Ссылки

[1] Jung MY, Jeon BS, Bock JY. Free, esterified, and insoluble-bound phenolic acids in white and red Korean ginsengs (Panax ginseng C. A. Meyer). Food Chem 2002;79:105—11.

[2] Baeg IH, So SH. The world ginseng market and the ginseng (Korea). J Ginseng Res 2013;37:1—7.

[3] Ministry_of_Agriculture FaRA. 2012 Ginseng Statistical Data (No. 11-1543000- 000004-10). In: Ministry of Agriculture FaRA; 2013. p. 2—7.

[4] Xiaoming S, Jian C, Kedsirin S, Ruili L, Songhua H. Enhancement of immune responses to influenza vaccine(H3 N2) by ginsenoside Re. Int Immuno pharmacol 2010;10:351—6.

[5] Kwok HH, Ng WY, Yang MS, Mak NK, Wong RN, Yue PY. The ginsenoside protopanaxatriol protects endothelial cells from hydrogen peroxide-induced cell injury and cell death by modulating intracellular redox status. Free Radical Bio Med 2010;48:437—45.

[6] Naval MV, Gomez-Serranillos MP, Carretero ME, Villar AM. Neuroprotective effect of a ginseng (Panax ginseng) root extract on astrocytes primary culture. J Ethnopharmacol 2007;112:262—70.

[7] Gao YG, Zang P, Hao JX, Li P, Li X, Zhang PJ, Zhou SG, Li R, Yang H, Wang YX, et al. The evaluation of contents of nine ginsenoside monomers in four commercial ginseng by reverse phase high performance liquid chromatog- raphy (RP-HPLC). J Med Plants Res 2012;6:3030—6.

[8] Yuan C-S, Wang C-Z, Mehendale SR. Commonly used antioxidant botanicals: active constituents and their potential role in cardiovascular illness. Am J Chin Med 2007;35:543—58.

[9] Lee KS, Kim GH, Kim HH, Chang YI, Lee GH. Volatile compounds of Panax ginseng C.A. Meyer cultured with different cultivation methods. J Food Sci 2012;77:C805—10.

[10] Lee JW, Do JH, Lee SK, Yang JW. Determination of total phenolic compounds from Korean red ginseng, and their extraction conditions. J Ginseng Res 2000;24:64—7.

[11] Park CK, Jeon BS, Yang JW. The chemical components of Korean ginseng. Food Ind Nut 2003;8:10—23.